#本文由馬爾文帕納科醫(yī)藥業(yè)務發(fā)展經(jīng)理 韓佩韋博士供稿#

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性研究對于加深對蛋白質(zhì)的結構和功能的了解有著非常重要的意義。差示掃描量熱技術（DSC）是直接測量熱轉變過程焓變（ΔH）的分析方法，例如蛋白質(zhì)，核酸或其他生物多聚物的熱變性過程，為表征蛋白質(zhì)及其他生物分子的熱穩(wěn)定性建立“金標準"技術。

一、焓變對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性意味著什么？

1，什么是焓（hán）變（ΔH）？

ΔH（焓變）是在恒壓狀態(tài)下將系統(tǒng)升高至溫度T過程中攝取的總能量。對于蛋白質(zhì)而言，這意味著用于使蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊所花費的能量（熱量），此過程中 ΔH 是為正值，代表這是一個吸熱過程。這種能量與蛋白質(zhì)中所有原子和分子運動相關，以及維系蛋白質(zhì)保持折疊構象中的鍵能。

通過將吸熱譜圖下方的面積進行積分（見圖 1）可以計算得到焓變（ΔH）。焓變用每摩爾蛋白質(zhì)的吸收的卡路里（或焦耳）來表示。由于蛋白質(zhì)在 DSC 實驗中暴露于升高的溫度，因此蛋白質(zhì)開始發(fā)生熱變性，并伴隨著非共價鍵的斷裂。焓變（ΔH）與維系蛋白質(zhì)天然（折疊）構象中所需的價鍵數(shù)量有關。焓變（ΔH）也取決于我們測量總蛋白質(zhì)濃度的準確程度。如果蛋白質(zhì)濃度不是很準確, 則會影響到計算出的ΔH值。

2，焓變（ΔH）值可以在實踐中告訴我們什么？

當您比較不同蛋白質(zhì)的DSC結果時，具有較大ΔH值的蛋白質(zhì)不一定比具有較小ΔH的蛋白質(zhì)更穩(wěn)定。由于ΔH值會對蛋白質(zhì)摩爾濃度歸一化，因此該值通常與蛋白質(zhì)的尺寸成比例。大多數(shù)蛋白質(zhì)具有相同的鍵密度（單位體積內(nèi)的價鍵數(shù)量），因此，期待具有較大分子量的蛋白質(zhì)也具有較大的焓變（ΔH）值也是合理的。

3，焓變（ΔH）的決定因素是什么？

焓變（ΔH）取決于溶液中天然蛋白質(zhì)的百分比。

一個非常重要的考慮是DSC僅測量初始處于折疊（天然）構象中的蛋白質(zhì)的ΔH值。ΔH值取決于具有折疊（活性）構象的濃度。如果初始折疊蛋白質(zhì)組分小于總蛋白質(zhì)濃度（即活性濃度小于100％），則計算出的ΔH值將相應地變小。

下圖顯示了在儲存期間的不同時間測量的相同蛋白質(zhì)的DSC圖譜。藍色曲線圖譜表示新鮮制備的蛋白質(zhì)，是100％天然（折疊）蛋白質(zhì)。當?shù)鞍踪|(zhì)樣品在儲存期間發(fā)生部分變性時，溶液中的天然蛋白質(zhì)的比例開始下降，導致DSC圖譜的焓變降低。當我們擁有100％天然蛋白質(zhì)的參考DSC圖譜時，我們可以根據(jù)不同狀態(tài)樣品的相對ΔH值來估計每個樣品中的折疊蛋白質(zhì)比例。

4，如何判斷蛋白質(zhì)是否失活？

到目前為止，我們已提及的焓變是指通過DSC儀器直接測量到的“熱"焓，也就是熱力學焓變，通常表示為ΔH_cal，這是其他任何非量熱技術，例如圓二色譜（CD），表面等離子共振（SPR）等技術不能獲取的焓變量。

還有另一種其他技術可以獲取的焓變類型，即范霍夫焓變 - ΔH_VH，我們同樣可以通過DSC數(shù)據(jù)計算得出。范霍夫焓變（ΔH_VH）可從通過DSC非兩狀態(tài)模型（non-2-state model）擬合得到。

兩種不同的焓變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的測定又有什么實際意義呢？

在DSC技術中，ΔH_cal僅由DSC熱轉變峰曲線積分的面積來確定，而ΔH_VH僅通過熱轉變峰曲線的形狀來確定。轉變峰形越尖銳，ΔH_VH越大，反之亦然。ΔH_cal是具有濃度依賴性的，但ΔH_VH不是。

若ΔH_cal/ΔH_VH比例為1，通常意味著所研究的熱轉變狀態(tài)符合兩狀態(tài)去折疊（Two-state unfolding model）模型。如果ΔH_cal/ΔH_VH比例大于1，則意味著存在顯著密集的中間體存在;  而ΔH_cal/ΔH_VH比小于1，則意味著存在分子間相互作用。

使用ΔH_cal/ΔH_VH可以幫我們估測是否有很大部分蛋白質(zhì)是失活的。如果我們有一個簡單的單結構域蛋白質(zhì)，并且假定沒有中間體，則我們可以預測，其去折疊過程的ΔH_cal/ΔH_VH的比值不會遠離1。因此，如果ΔH_cal顯著低于ΔH_VH，可以表明很大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)失活。

綜上所述，對DSC中ΔH數(shù)據(jù)的分析可以讓我們了解蛋白質(zhì)的去折疊機制，以及多少蛋白質(zhì)處于其活性的天然構象。

二、TM值如何與和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關？

中點轉變溫度T_M

我們可以從DSC數(shù)據(jù)中提取多個熱力學參數(shù)，例如ΔH，ΔHVH（范霍夫焓變），ΔCP和ΔG，但*泛使用的參數(shù)是T_M。順便提一下，這也是最容易和最準確的值 - T_M是最大峰值所對應的溫度。

 “蛋白質(zhì)穩(wěn)定性"有多種定義。最常見的是，對于工業(yè)上有重要意義的蛋白質(zhì)，該術語是指在生理溫度下的功能（或操作）穩(wěn)定性; 即，他們可以在37°C下發(fā)揮多長時間的生物功能？這可以通過需要花幾天或數(shù)周時間的等溫研究來評估，或者，如果使用差示掃描量熱法（DSC），則可以在幾分鐘內(nèi)變性蛋白質(zhì)。

通過DSC獲得的哪個熱力學參數(shù)與功能穩(wěn)定性相關度最佳？事實證明，是T_M值。

熱力學穩(wěn)定性（ΔG）是功能穩(wěn)定性的較差的預測因子; 技術上，ΔG僅適用于可逆去折疊過程，此外，它由T_M，ΔH和ΔCP計算得到，后者可能很難獲取。

一個例子是T_M和ΔG與肉桿菌蛋白抗原血清型C的半數(shù)聚集時間(half time)（作為功能穩(wěn)定性的量度）的相關性，用作模型蛋白。ΔG與T_{1 / 2 agg.} 相關系數(shù)（R）僅為0.4，而T_M 與 T_{1 / 2 agg.}的相關系數(shù)是0.92。（來自J Pharm Sci的數(shù)據(jù)，2011 Mar; 100（3）：836-48）

思考T_M的一種方式：

如下圖所示，假設我們用 DSC 掃描兩種不同配方中的蛋白質(zhì)或兩種不同的蛋白質(zhì)構建體，則 T_M 值向低溫方向 5℃ 的負偏移（穩(wěn)定性下降）實際上反映了在 37℃ 條件下的 Fu （蛋白去折疊比例）由2％增加到 3％。溫度 T 下的 Fu 蛋白可以通過圖像化的方式估算，即溫度 T 以下的曲線下陰影區(qū)域面積和整個曲線下方面積的百分比。

由于聚集體的生成可能是濃度依賴的過程，因此較高濃度的去折疊蛋白質(zhì)（紅色掃描曲線）將導致較快的聚合（更大組分的去折疊狀態(tài)（U）才能轉換為不可逆變性狀態(tài)（I）。參見下面的原理圖。

這種解析的一個推論是，曲線的整體形狀應該是相似的。我們假定這種情況是對于在不同配方中的相同蛋白質(zhì)或由一個母分子衍生出來的具有相似構建體的蛋白質(zhì)。但是，對于*不同的蛋白質(zhì)，使用T_M值作為用于穩(wěn)定性比較的預測指標則應該謹慎使用。

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Differential Scanning Calorimetry (DSC): Theory andpractice

Differential Scanning Calorimetry (DSC) forBiopharmaceutical Development: Versatility and Power

The Power of Heat: Digging Deeper with DifferentialScanning Calorimetry to Study Key Protein Characteristics

PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀：DSC

差式掃描量熱法（DSC）是一種直接分析天然蛋白質(zhì)或其他生物分子熱穩(wěn)定性的技術，無需外在熒光素或者內(nèi)源熒光，它通過測定在恒定的升溫速率下使生物分子發(fā)生熱變性過程中的熱容變化來實現(xiàn)。

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